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　?。ǎ┐郎y樣品孔中每孔加入待測樣品00μl，每種樣品設(shè)3個平行孔；設(shè)兩個陰性對照孔，每孔加未處理組的細胞裂解液00μl；另設(shè)一個空白對照孔，加入純細胞裂解液00μl?！。?）酶標板置4℃，包被過夜。

　?。?）洗板：吸干孔內(nèi)反應(yīng)液，用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去），之后將洗滌液注滿板孔，浸泡-2分鐘，間歇搖動。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。

　?。?）陰性對照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。

　?。?）酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。

　　（6）洗板，同（4）。

　　（7）每孔加:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 00μl。

　　（8）酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。

　?。?）洗板，同（4）。

　?。?）每孔加TMB顯色液 00μl，輕輕混勻0s，置37℃暗處反應(yīng)5-20min。

　　（）每孔加00μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

　　（2）分別測450nm 吸光值W和630nm吸光值W2，zui終測得的OD值為兩者之差（W-W2），以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

　?。?）數(shù)據(jù)處理：在得出標本（S）和陰性對照（N）的 OD值后，計算S/N值。S/N≥2.為陽性判定標準。

　　注：所用溶液配方

　　（） PBS：稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?2H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl，加雙蒸水至000ml。

　?。?）包被緩沖液：稱取.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3，加雙蒸水至 000m。

　?。?）洗滌液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS。

　?。?）稀釋液：含0.%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，主要用以稀釋抗體、標準品、樣品。

　?。?）TMB顯色液：稱取.84g Na2HP04.2H20, 0.5 g檸檬酸，加雙蒸水至O0ml，配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用0.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解錠TMB，再加入35μl 3% H2O2

　?。?）細胞裂解液：% TritonX-00，37mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，mmol/L PMSF，pH 7.4。（其中PMSF溶于異丙醇中，配成O mmo/L，-20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/div>